目的蛋白的翻译后修饰与迁移

目的蛋白可能以多种形式存在，其中翻译后修饰最为常见，包括糖基化、磷酸化、泛素化、甲基化和乙酰化等。这些修饰往往会影响蛋白的表观分子量。例如，CD2蛋白的理论分子量约为39kDa，而其实际表观分子量通常在45kDa左右，显示出糖基化的影响。为了探究不同分子量的成因，可以通过添加糖苷酶PNGaseF去除糖基后进行Western Blot (WB) 分析。糖基化、乙酰化和甲基化等修饰通常会造成表观分子量的增大，而磷酸化的影响则可能不明显或也会增大。

剪切导致的蛋白变体

以Caspase-7为例，其存在多种形式，包括Procaspase-7（分子量约37kDa）、Intermediate caspase-7（约28kDa）和Caspase-7p20（约20kDa）。Procaspase-7为未活化状态，当细胞感受到凋亡信号时，它会通过自剪切或其他caspase的作用被激活。这种激活过程会导致分子量的变化，活性亚单位结合后形成异二聚体。在实验中，需要设置诱导组与未诱导组进行对比验证，剪切过程会使表观分子量降低。

小分子量蛋白的电泳迁移问题

尊龙凯时建议在分离小于20kDa的蛋白时采用Tricine-SDS-PAGE体系。传统的Tris-Glycine体系对小分子量蛋白的分离效果不佳，主要由于以下原因：离子前峰的影响、低分子量蛋白的迁移问题以及缓冲系统pH值的高低。这些因素会导致蛋白在电泳过程中的聚集或降解，影响分辨率。因此，Tricine-SDS-PAGE可以通过降低游离DS-离子的生成，提高小分子量蛋白的分离效果。在处理样本时，保持样本的新鲜，并选择合适的裂解液是至关重要的。

预染Marker的使用

尽管预染Marker在操作上更为便捷，但因其附着染料，可能导致分子量的偏移。在不同的电泳体系中，同一Marker的迁移速度也可能有所不同，因此需谨慎选择与验证。

样本制备的注意事项

在进行蛋白质分析时，样本制备的每个步骤均可能影响结果。膜蛋白在95度加热时可能会聚集而导致表观分子量增加。此外，样本的充分变性和还原处理是必要的，以确保抗原表位的显露。保证上样缓冲液使用充足且在有效期内，同时应仔细选择裂解液，使样本在制备时保持新鲜，以避免蛋白降解。

总结

在进行蛋白质分析和Western Blot实验时，关注样本的表达情况及表达丰度是关键，并需查阅厂家的验证图来评估抗体的特异性。通过充分的理解和规范的操作步骤，我们可以为蛋白质的研究与分析打下坚实的基础。 尊龙凯时将为您的实验提供专业的支持与优质的产品，助力科研进展。