## 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度设置为37℃。

## 传代方法

首次传代建议比例为1:2。传代后2天更换培养液，使用无菌离心管收集培养基，作为对比培养的过渡材料。如果对比效果不理想，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基，购买时还有优惠。

细胞收到后，可使用处理培养，待细胞状态良好后，将完全培养液灌满瓶口并封好，这是运输细胞的最佳方法。在收到细胞后，用75%酒精喷洒整瓶，消毒后在超净台内进行严格的无菌操作，然后将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。

通过显微镜观察细胞生长情况，并进行不同放大倍数的拍照保存（最好分别拍摄40x、100x、200x的图像），前三天的照片作为重要的售后依据，若不提供照片，则默认收到的细胞状态良好。

## 细胞培养步骤

对于贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，随后通过显微镜观察细胞的消化情况；若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲打培养瓶后，加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保完全脱落后吸出细胞液，然后将悬液转移至离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml的完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后将瓶放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

对于悬浮细胞的传代步骤：

1. 采用半换液法：静置培养瓶于培养箱中。
2. 采用离心换液法：如需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中。

## 细胞冻存步骤

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养液以终止消化，然后轻吹使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清，沉淀细胞，加入1ml尊龙凯时的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将细胞冻存管直接放入-80℃冰箱，若后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时后再转入液氮罐。

## 细胞复苏步骤

1. 从液氮中取出细胞冻存管（佩戴防护面具），快速置入37℃水浴解冻，直至无结晶形成，随后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，并以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清后，沉淀细胞加入5ml完全培养基进行重悬，最后接种至T25培养瓶，存放于37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养；第二天换用新鲜完全培养基。

## 注意事项

注意某些细胞可能贴壁不牢，在运输过程中容易发生脱落，这是正常现象。如脱落较多，可以将培养瓶中的所有培养液收集至离心管，利用上清作过渡培养（后期用于对比培养），沉淀后加入胰蛋白酶进行细胞培养。